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技術(shù)文章

三聚氰胺檢測方法

更新日期:2018年6月25日 大字 小字
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檢測方法
利用酶聯(lián)免疫吸附測定法用食品及飼料中三聚氰胺的定量測定。
檢測原理
酶聯(lián)免疫吸附測定法定量測定三聚氰胺殘留。利用萃取液通過均質(zhì)及振蕩的方式提取樣品中的三聚氰胺進(jìn)行免疫測定。先將三聚氰胺酶標(biāo)記物,樣品萃取物及標(biāo)準(zhǔn)加入到已經(jīng)包被有三聚氰胺抗體的微孔中開始反應(yīng)。在30分鐘的孵育過程中,樣品萃取物中的三聚氰胺與三聚氰胺酶標(biāo)記物競爭結(jié)合微孔中的三聚氰胺抗體,孵育30分鐘后洗掉小孔中所有沒有結(jié)合的三聚氰胺及三聚氰胺酶標(biāo)記物。在用去離子水清洗結(jié)束后,每孔中加入清澈的底物溶液,結(jié)合的酶標(biāo)記物將無色的底物轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的物質(zhì)。孵育30分鐘后停止此反應(yīng),根據(jù)各孔顏色深淺進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的顏色得出樣品中三聚氰胺的的濃度值。 

實(shí)驗(yàn)所需設(shè)備及材料
三聚氰胺檢測試劑盒(目前常用進(jìn)口試劑有美國Abraxis公司和美國Beacon公司的)
酶標(biāo)儀一臺(tái)(配有450nm濾光片)
1-5ml可調(diào)移液器
100-1000ul可調(diào)移液器. 
20-200ul可調(diào)移液器.
蒸餾水或去離子水.. 
可吸取50ul的移液器及吸頭. 
可吸取50ul和100ul的八道移液器及吸頭. 
吸水紙或相當(dāng)?shù)奈牧? 
450nm的酶標(biāo)儀. 
計(jì)時(shí)器. 
洗瓶 
混旋器. 
20mM PBS: 0.62g NaH2PO4-2H2O+5.73gNa2HPO4-12H2O+9gNaCl ,蒸餾水定容至1000ml.


注意事項(xiàng) 
最好配套使用試劑,不要同其它公司的產(chǎn)品混用,不要將不同批次的產(chǎn)品混用。 
樣品稀釋或含有雜質(zhì)很可能對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性有影響。 
不要使用過期的產(chǎn)品。 
使用之前將所有試劑回升至室溫,但不要放置超過24小時(shí)。 
三聚氰胺屬于有毒性的化學(xué)品,請(qǐng)小心處理。 
停止液是1N鹽酸,避免接觸皮膚。 

樣品制備 (以美國Beacon試劑為例)
濕的寵物食品萃取方法(稀釋倍數(shù):100) 
均質(zhì)樣品至布丁狀。 
稱取2g樣品加入10mL 60%甲醇/水溶液,并劇烈振蕩。 
超聲萃取1分鐘。 
漩渦混合1分鐘,然后靜置5分鐘,使樣品分層。 
3000 g 室溫離心5分鐘。 
用玻璃纖維濾紙過濾上清液,并將萃取液收集于一干凈試管中。 
用樣品稀釋液將濾液20倍稀釋(如:0.1mL濾液+1.9mL 10%甲醇/20mMPBS) 
移取150 ul 進(jìn)行分析。 
注意:用此方法測定了8個(gè)添加有15ppm三聚氰胺的貓糧(非要求召回),回收率范圍為75%-117%。 
本方法只可作為樣品篩選方法,不可作為最終確認(rèn)方法。 

小麥面筋蛋白萃取方法:(稀釋倍數(shù):500) 
1.均質(zhì)或混勻小麥面筋蛋白樣品。 
2.稱取0.2g均質(zhì)好的樣品加入10mL 酸化的60%甲醇/水溶液(1mL 1N HCl/ 100mL 60%甲醇/水)。 
3.漩渦混合并超聲萃取,使樣品溶解(確保樣品中沒有結(jié)塊)。 
4.用樣品稀釋液稀釋萃取液按照1:10比例。(0.5mL+4.5mL 10%MeOH/20 mM PBS)。 
5.10000轉(zhuǎn)/分離心上清液10分鐘。 
6.用G6玻璃纖維濾紙過濾上清液,并將萃取液收集于一干凈試管中。 
7.移取150 ul 進(jìn)行分析。 

注意:如果樣品中含有大量的添加物,需要加入更大量的萃取溶液,以保證萃取效率。
操作人依據(jù)自己的判斷力,如果測試結(jié)果比較高,需要加入兩倍的萃取溶液(0.2/20mL),進(jìn)行二次測定。 

干的寵物食品萃取方法(稀釋倍數(shù):200) 
1.質(zhì)器均質(zhì)干的寵物飼料樣品。 
2.稱取1g樣品加入10mL 60%甲醇/水溶液,并劇烈振蕩。 
3.超聲萃取1分鐘。漩渦混合1分鐘,然后靜置5分鐘,使樣品分層。 
4.3000 g 室溫離心5分鐘。 
5.用G6玻璃纖維濾紙過濾上清液,并將萃取液收集于一干凈試管中。 
6.用樣品稀釋液將濾液20倍稀釋(如:0.1mL濾液+1.9mL 10%甲醇/20mMPBS) 
7.移取150 ul 進(jìn)行分析。 

免疫測定過程 (注意: 標(biāo)準(zhǔn)及樣品最好做平行試驗(yàn)以增加準(zhǔn)確度) 
將所有試劑及樣品回升至室溫20-280C,但不要放置超過24小時(shí)。 
從鋁箔袋中拿出要求數(shù)量的微孔條,放入干燥劑并重新封好袋子以免微孔條受潮 
吸取150ul標(biāo)準(zhǔn)、樣品到對(duì)應(yīng)微孔中,必須保證每種溶液使用干凈的吸頭吸取,避免交叉污染。 加入50ul三聚氰胺酶標(biāo)記溶液到每個(gè)小孔中。 
混合60秒,20-28攝氏度下孵育30分鐘。 
將微孔中的溶液倒入水槽中,用蒸餾水完全充滿微孔,震蕩后倒掉,重復(fù)三次,總共四次洗板。 
在吸水紙上拍打,盡可能將水拍干。 
每個(gè)微孔中加入100ul底物溶液。 
20-28攝氏度下,孵育30分鐘。 
每個(gè)微孔中加入100ul停止液。 
450nm下讀板。 

結(jié)果分析 
半定量的結(jié)果是由樣品的吸光率與標(biāo)準(zhǔn)的吸光率的簡單對(duì)比而來判定:樣品的顏色比標(biāo)準(zhǔn)的顏色淺則三聚氰胺的濃度比標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度高, 樣品的顏色比標(biāo)準(zhǔn)的顏色深則三聚氰胺的濃度比標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度低。 
定量分析需要繪制以標(biāo)準(zhǔn)樣的吸光率為X軸,以標(biāo)準(zhǔn)樣的濃度的半對(duì)數(shù)為Y軸的曲線圖.依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣吸光率的點(diǎn)畫成一直線,如此樣品的光吸收率可在線上找到,與此相對(duì)應(yīng)的Y軸則為樣品的濃度,樣品光吸收率范圍應(yīng)比標(biāo)準(zhǔn)樣的最底范圍高,比最高范圍低, 即可說明此樣品中三聚氰胺的含量大于500ppb或小于20ppb。